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PNA寡核苷酸處理方案

更新時(shí)間:2024-08-08      點(diǎn)擊次數(shù):681

1.PNA具有較高的親和力和特異性。

2.富含嘌呤的PNA低聚物的溶解度降低,并傾向于聚集。建議低聚物的嘌呤含量低于50%,在PNA夾中一個(gè)低聚物的嘌呤(特別是G堿段不超過6段),因?yàn)樗苄苑浅V匾?梢蕴砑觾蓚€(gè)賴氨酸來提高長PNA或具有高嘌呤的PNA的溶解度。

存儲(chǔ) 和 處理

1.PNA作為凍干粉(超過5年)或作為水中溶液(至少一年)儲(chǔ)存起來非常穩(wěn)定-20°或更低。對于長期存儲(chǔ),-70°

2.當(dāng)準(zhǔn)備使用時(shí),向下旋轉(zhuǎn)試管,將50n摩爾的PNA溶解在1 ml無菌水中,制成50 uM的原液。渦旋和混合良好,以

實(shí)現(xiàn)*全溶解。

3.平均分配和儲(chǔ)存在-20°或-70°工作原液可以進(jìn)一步稀釋10倍(5毫米,10倍),并在4度下保存幾周。

4.當(dāng)PNA解凍時(shí),加熱至55°中浸泡5分鐘,以實(shí)現(xiàn)*全溶解。

PCR 反應(yīng)

*下面是一個(gè)例子。實(shí)際情況可能根據(jù)序列而變化,需要根據(jù)經(jīng)驗(yàn)來確定。

1.準(zhǔn)備以下PCR混合。

a.25 ul 2x PCR混合物

b.FW和RV PCR引物分別為最終0.2 uM

c.5 ul PNA鉗夾(5 uM庫存)至最終0.5uM(范圍:0.2~5 uM)

d.DNA模板: 20 ng(10~50 ng)

e.水至50 ul

2.按如下方法運(yùn)行PCR程序。

a.變性:94 3 min

b.放大(22~40循環(huán))

i.變性:94 30 sec

ii.PNA夾具:65~75為20秒(比PNA工具計(jì)算的Tm低5~10度)

iii.底漆退火:55~65為20秒

iv.擴(kuò)展:68為30秒

c.擴(kuò)展:72, 10 min

d.保持在4

3.取5ulPCR產(chǎn)物,在瓊脂糖凝膠上運(yùn)行。

4.夾緊反應(yīng)中最常見的PNA濃度為0.4~2 uM。一般來說,如果溶解度不受影響,更高濃度的PNA可以提供更好的夾緊效果。


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